总抗氧化能力（FRAP法）测试盒（比色法）

 总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒说明书

                                                       微量法100T/96S

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

研究意义：

测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。

测定原理：

在酸性环境下，还原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ的能力反映了总抗氧化能力。

自备实验用品：

恒温水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，使用前预冷。

试剂一：液体15mL×1瓶，避光保存。

试剂二：液体1.5mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体1.5mL×1瓶，避光保存。

混合液(现配现用)：将试剂一、试剂二、试剂三按10:1:1的比例混合，使用前37℃预温。

样品的制备：

(1) 血清、血浆、唾液或尿液等液体样品

血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用EDTA抗凝）4℃，5000rpm 离心10min，取上清待测。血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过30 d）后再测定。

(2) 组织样品

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

(3) 细胞样品

按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

操作步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至593nm，蒸馏水调零。
2. 操作表

	空白管	测定管
混合液（μL）	180	180
样品（μL）		6
双蒸水（μL）	24	18
充分混匀，反应20min，于微量石英比色皿/96孔板，测定593nm吸光值，△A= A测定-A空白

注意：空白管只需测定一次。

总抗氧化能力计算公式：

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y=0.8442x-0.0048，R2=0.9979

1. 按样本质量计算

单位定义：每g样本每分钟产生1μmolFe2+-TPTZ定义为一个酶活力单位。

总抗氧化能力（U/g 鲜重）=（△A+0.0048）÷ 0.8442×1000×V样÷(V样÷V样总×W)÷T

                        =59.228×（△A+0.0048）÷W

2. 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg蛋白每分钟产生1μmolFe2+-TPTZ定义为一个酶活力单位。

总抗氧化能力（U/mg prot）=（△A+0.0048）÷0.8442×1000×V样÷(V样÷V样总×Cpr)÷T

                        =59.228×（△A+0.0048）÷Cpr

3. 按细胞计算

单位定义：每万个细胞每分钟产生1μmolFe2+-TPTZ定义为一个酶活力单位。

总抗氧化能力（U/104cell）=（△A+0.0048）÷0.8442×1000×V样÷（V样÷V样总×细胞数量（万个））÷T

= 59.228×（△A+0.0048）÷ 细胞数量（万个）

4. 按液体体积计算

单位定义：每毫升样本每分钟产生1μmolFe2+-TPTZ定义为一个酶活力单位。

总抗氧化能力（U/mL）=（△A+0.0048）÷0.8442×1000÷T

= 59.228×（△A+0.0048）

V样总：加入提取液体积，1 mL；V样：反应中样品体积，6μL；T：反应时间，20min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.4221x - 0.0048；R2=0.9979

1. 按样本质量计算

单位定义：每g样本每分钟产生1μmolFe2+-TPTZ定义为一个酶活力单位。

总抗氧化能力（U/g 鲜重）=（△A+0.0048）÷0.4221×1000×V样÷(V样÷V样总×W)÷T

                        =118.455×（△A+0.0048）÷W

2. 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg蛋白每分钟产生1μmolFe2+-TPTZ定义为一个酶活力单位。

总抗氧化能力（U/mg prot）=（△A+0.0048）÷0.4221×1000×V样÷(V样÷V样总×Cpr)÷T

                        =118.455×（△A+0.0048）÷Cpr

3. 按细胞计算

单位定义：每万个细胞每分钟产生1μmolFe2+-TPTZ定义为一个酶活力单位。

总抗氧化能力（U/104cell）=（△A+0.0048）÷0.4221×1000×V样÷（V样÷V样总×细胞数量（万个））÷T

= 118.455×（△A+0.0048）÷ 细胞数量（万个）

3. 按液体体积计算

单位定义：每毫升样本每分钟产生1μmolFe2+-TPTZ定义为一个酶活力单位。

总抗氧化能力（U/mL）=（△A+0.0048）÷0.4221×1000÷T

= 118.455×（△A+0.0048）

V样总：加入提取液体积，1 mL；V样：反应中样品体积，6μL；T：反应时间，20min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL

 

注意事项：

1. 试剂二对人体有刺激性，请采取适当的防护措施。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴乳胶手套操作。
2. 尽量避免使用在酸性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂，否则对本试剂盒的检测结果产生干扰。
3. 样品中不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢剂和DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。