|
磷脂酶C（PLC）测试盒（比色法）
|
磷脂酶C（ Phospholipases C，PLC ）试剂盒说明书
微量法100T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
磷脂酶C（EC3.1.4.3）是一种水解甘油磷酸酯C3位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶，广泛存在于微生物及动植物的组织和细胞中，在细胞代谢、细胞传递、生长发育等方面具有重要作用。
测定原理
磷脂酶C催化水解NPPC产生对硝基苯酚，在410nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体102mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体8mL×1瓶，4℃保存。
酶液提取
测定操作
|
|
空白管 |
测定管 |
|
样品（μL） |
|
20 |
|
试剂一（μL） |
20 |
|
|
试剂二（μL） |
100 |
100 |
|
充分混匀，37℃反应30min |
||
|
试剂三（μL） |
80 |
80 |
|
充分混匀，于微量石英比色皿/96孔板，蒸馏水调零，测定410nm处吸光值，分别记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。 |
||
酶活计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0191x - 0.0103，R2 = 0.9991
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 17.45×（△A+0.0103）÷ Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
= 17.45×（△A+0.0103）÷ W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/104 cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量) ÷T
= 17.45×（△A+0.0103）÷ 细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/mL）= （△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷V样÷T
= 17.45×（△A+0.0103）
V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
标准曲线：y = 0.0095x - 0.0103，R2 = 0.9991
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 35.09×（△A+0.0103）÷ Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
= 35.09×（△A+0.0103）÷ W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/104 cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量) ÷T
=35.09×（△A+0.0103）÷ 细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/mL）= （△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷V样÷T
= 35.09×（△A+0.0103）
V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
产品说明书