核糖核酸酶抑制因子的抗体制备与纯化及ELISA法对其药代动力学的研究2018-11-22

肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一。传统的化疗药物主要从直接杀伤肿瘤细胞入手，同时对正常细胞亦有毒副作用。核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitot，RI)抑制肿瘤的作用则是通过与血管生成因子(Angiogenin，Ang)紧密结合，抑制肿瘤血管的生成，阻断肿瘤细胞的氧气及营养供应，从而使肿瘤细胞停止生长，而对正常细胞却无毒副作用。我们实验室对RI的抗肿瘤研究进行了大量工作，实验表明，从人胎盘和猪肝中提取的RI，可以抑制乳腺癌实体瘤Ca761，肉瘤S180，肝癌实体瘤H22的生长。因此将其作为抗肿瘤药物开发利用无疑为肿瘤治疗提供了一种新思路。 国内外有关RI的研究多集中在结构方面，对其功能尤其是将RI作为抗肿瘤药物的研究报道较少。本实验室已报告RI具有良好的治疗多种肿瘤疗效；本研究在已有的基础上成功制备了RI抗体并进行纯化，应用ELISA法对RI的药代动力学进行了初步探索。 RI是哺乳动物细胞浆中的一种酸性糖蛋白，分子量约为50kD，取RI 200μg/只动物，加等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后免疫家兔，经检测当抗血清效价达到5000以上时采血。通过SDS-PAGE分析，在约55kD处有清晰条带，为RI的抗体免疫球蛋白TgG。 Recombinant Protein(rProtein)A Sepharose Fast Flow是一种亲和性介质，重组蛋白A与Sepharose Fast Flow偶联后，增强了特异性结合IgG Fc段的能力，这种共价结合使抗血清中的免疫球蛋白IgG得到高度纯化。为了进一步提高纯化效率，本文对实验条件进行筛选优化，确定了上样量为2ml，洗脱液梯度浓度最高为30％，经吸光度及蛋白含量测定确定组分收集为9～16管(1ml/管)。纯化后的抗体IgG进行SDS-PAGE，在约55kD处有单一条带，经western-blot检测有特异性条带出现(约50kD处)，说明纯化效果较好。ELISA法测其效价，滴度达64，000以上，活性保持得很好，其稳定性可达12个月以上。 随着生化技术的迅速发展，蛋白药物的开发日益受到重视，但其生理活性强， 用药剂量小，致使体液中药物浓度很低，要求检测方法必须具有极高的灵敏度。 故本实验选用了检测可达pg~ng/m1级水平的EL工SA法。实验中采用间接EL工sA法 测抗原，建立了标准曲线，并对测定条件进行优化，确定了一抗稀释度为1:4000， 二抗稀释度为l:2000，BSA封闭液浓度为2%。同时对其方法学进行考证，灵敏度 可达0.05 pg/m1，批内变异系数为9.28%，批间变异系数为13.56%，一抗稀释4000 倍后，稳定性可达6个月以上。 目前国内外尚无RI抗体出售，本实验制备及纯化的RI抗体除了可用于 Western一blot检测外，还极有希望成为肿瘤的早期诊断的一个新指标(本实验室 已通过实验证明恶性肿瘤患者红细胞中RI活性下降，瘤组织内RI基因表达下降)。 R1作为抗肿瘤药物其药代动力学研究未见报道，本文对EL工SA法进行了初步探讨， 为以后的测定方法提供了一定的实验基础，进而为RI的药代动力学深入研究打下 了良好的基础。