叶绿体是植物细胞中特有的细胞器,其内含有DNA。叶绿体DNA呈环状,高等植物的叶绿体DNA(cpDNA)在120～160kb之间大小不一,现已发现的最大叶绿体DNA达到217kb。与分离线粒体DNA的方法相似。本实验首先是制备植物新鲜组织匀浆、过滤,分离出完整的叶绿体,然后通过蔗糖密度梯度离心,把叶绿体与其他亚细胞结构分离开来。完整叶绿体经蛋白酶K酶解后,再通过酚-氯仿抽提获得高纯度的叶绿体DNA。
以下所有操作除特别指明外均在4℃进行。将搅拌器和离心管预冷,使用冷藏的缓冲液并在冰筒中操作。
1.准备750ml缓冲液A,使用前往500ml缓冲液中加入BSA。
2.收集25～30g健康的嫩叶,在提取之前可将植株置于黑暗中培养24～28h以降低淀粉含量。如果植物材料已被感染或弄脏了,可先用次氯酸钠(5%)处理5min,然后用自来水漂洗2～3次。
3.除去叶片中间的叶脉,称重。此法适用于约20g的植物材料。将叶片切成1cm2大小的碎片,将10g碎片置于含有BSA的约200～250ml的缓冲液A中(只有在匀浆时使用的缓冲液A中加入BSA),在搅拌器中高速匀浆,每次约10s,重复2～3次。
4.用50μm的尼龙筛过滤提取物。在含BSA的200～250ml缓冲液A中对所剩的碎片再次匀浆和过滤。不能通过50μm尼龙筛的匀浆物可集中起来再匀浆,每次10s,重复两次,再过滤。
5.用20μm的尼龙筛对提取物进行第二次过滤。
6.提取液3000r/min离心10min。
7.用软笔刷轻轻将沉淀重悬于30ml不含BSA的缓冲液A中,再离心。绿色沉淀的底部可见白点,那是淀粉,应尽量避免重悬起淀粉。根据淀粉的含量,可以重复这一冲洗步骤4～6次。
8.在冲洗的同时,可以制备蔗糖梯度液。分级梯度液底层为3.5ml60%的蔗糖溶液,中间为3.5ml40%的蔗糖溶液,顶层为3.0ml20%的蔗糖溶液,不同梯度层要轻轻混匀,得到扩散中间相。可以用一个长的巴氏吸管小心地在层间上下搅动几次(巴氏吸管的末端开口应封上)。
9.小心将沉淀物重悬于总体积2～6ml的缓冲液A中,将悬液分别加入有分级梯度液的2～6个小管中。梯度平衡后置于水平转头上26000r/min4℃离心1h。
10.将位于45%～20%蔗糖溶液中间层的叶绿体带用宽口移液管转至50ml的离心管中。
11.缓慢加入3倍体积的缓冲液A(防止叶绿体破裂)。开始时逐滴加入并轻轻搅匀(全部加完约要10～15min)。5000r/min离心5min,收集叶绿体。
12.小心将沉淀重悬于3ml缓冲液A中,加入1/5体积的缓冲液B(用前加入蛋白酶K),并于50℃保温15min,使叶绿体裂解。
13.在室温下抽提叶绿体DNA2次。加入1倍体积的酚(以TE饱和),颠倒小管数次混匀。室温下5000r/min离心10min,使两相分离。收集上层溶液,再用1倍体积的酚-氯仿(1∶1,V/V)抽提一次。
14.将DNA溶液(水相)转至一个30ml的离心管中,加入1/10体积3mol/L乙酸钠和2.5倍体积的99%乙醇,-20℃沉淀DNA过夜。
15.在4℃下,10000r/min离心15min,收集DNA。
16.弃上清液,真空抽干沉淀(不要过度抽干沉淀)。
17.将DNA溶于400μlTE缓冲液,这可能需要几个小时,将小管放于冰上操作。
18.把DNA转至一Eppendorf管中,加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2体积的99%乙醇,-20沉淀DNA过夜。
19.在微型离心机上,4℃,13000r/min离心15min,收集DNA。
20.弃上清液,用20%乙醇清洗沉淀,再离心,重复清洗步骤。离心,真空抽干沉淀。
21.将沉淀溶于50～150μlTE缓冲液中,在-20℃或4℃保存。DNA产量一般可达10～100μg。
