ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。在检测时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体反应。洗涤后加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
ELISA原理免疫分析是一种利用特定抗体与抗原或半抗原发生的高选择性高特异性识别和结合原理，对待测抗体或者抗原进行分析测定的方法，酶联免疫吸附分析（下称ELISA）是免疫分析的一种，分三个部分组成：免疫识别，信号输出和数据处理。
ELISA双抗体夹心法是一种常用的免疫测定方法，主要用于检测抗原。以下是该方法的操作步骤：
1. 包被抗体：
将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体（如96孔板）结合，通常通过物理吸附或化学偶联的方式。这一步骤需要将抗体溶液均匀地覆盖在板孔表面，然后在室温或4°C下孵育过夜，以便抗体充分吸附。
洗板：用洗涤缓冲液（如PBST，即磷酸盐缓冲液加吐温20）清洗板孔，去除未结合的抗体和其他杂质。
2. 封闭：
为了减少非特异性结合，使用封闭液（如1% BSA或5%脱脂牛奶的PBST溶液）填充板孔，封闭未结合的表面，室温孵育2小时或根据具体实验调整时间。
洗板：再次使用洗涤缓冲液清洗，确保封闭液被彻底清除。
3. 加样：
在相应的孔中加入待测样品和标准品。样品应稀释至适当浓度，以便于后续分析。阴性对照和阳性对照也应加入以验证实验的准确性。
确保加样时避免气泡产生，且每孔加样量一致，通常为100μL。
4. 温育：
将板条放入37°C的温育箱中，让待测抗原与固相上的捕获抗体充分结合。根据不同的抗原和抗体，孵育时间可能从30分钟到2小时不等。
5. 洗板：
温育结束后，再次使用洗涤缓冲液彻底清洗板孔，以去除未结合的抗原。
6. 加检测抗体：
用PBST稀释的检测抗体（即识别抗体）加入每个孔中，继续在37°C下孵育，时间一般为1小时。
7. 洗板：
再次用洗涤缓冲液清洗，去除未结合的检测抗体。
8. 加酶标二抗：
将稀释后的酶标记二抗加入每个孔中，再次在37°C下孵育1小时。
9. 洗板：
再次用洗涤缓冲液清洗，以确保只有与抗原捕获抗体复合物结合的酶标记二抗留在孔内。
10. 显色：
加入底物溶液（如TMB），在室温避光条件下孵育，直到颜色达到一定深度。TMB在过氧化物酶的作用下转化为蓝色，随后加入终止液（如硫酸）变为黄色。
11. 读取结果：
使用酶标仪在450nm波长下读取每个孔的吸光度（OD值）。OD值与样品中抗原的浓度成正比。
12. 数据处理：
通过绘制标准曲线（以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标），并利用软件进行四参数拟合，可以将样品的OD值转换为相应的抗原浓度。
整个过程中，每一步的准确性和操作的一致性至关重要，以确保实验的重复性和结果的可靠性。此外，根据实验的具体需求，某些步骤可能会有所调整。
