实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
荧光定量PCR实验样品RNA的抽提步骤::
1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA抽提的技巧:
1：快速阻止Rnase活性–样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活Rnase。
2：选择合适的抽提方法–高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。
3：预判质量要求– Northern，cDNA文库构建对完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay)对完整性要求不是很高。RT-PCR对纯度(酶抑制物残留)要求很高。
4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。
5：检查 RNA的完整性–电泳检测，28S:18S =2:1是完整的标志，1:1对大部分实验也是可以接受的。
6：去除DNA –用于RT-PCR, array analysis最好用Dnase I去除DNA。
7：降低外源酶的污染–不能从外面又导入酶。
8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及DNA污染。
9：彻底溶解RNA，必要时可以65C加热5分钟。
10：合适的保存方法–短时间可以–20C保存，长期请保存于–80C。
