标本制作:可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片,经适当固定或不固定,作免疫荧光染色用。
根据一抗是否直接带荧光标记,将免疫荧光染色分为直接染色或间接染色。
直接染色法是携带荧光素的抗体直接与标本内的抗原反应,形成抗原—荧光素标记抗体复合物,该法优点是较简单,特异性较高;缺点:应用范围较窄,敏感性也较低。
实际上在实验室中,我们最常使用的还是间接染色法,先用特异性抗体与细胞内相应抗原结合,再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合,形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物。
下面以间接染色法为例展开叙述:
实验步骤:
1. 复温复温:取出制作好的样本(短期存放-20℃,长期存放-80℃保存),恢复至室温后,用1xPBS洗涤三次,每次 5 分钟;
2. 抗原修复:用0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)充分浸泡样本,微波炉中低火加热修复,保持微沸状态5 min效果最好;
3. 破膜:用 0.5%Triton X-100( 1xPBS配制 )室温通透20 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);
4. 封闭:封闭液蛋白的选择原则是与一抗蛋白和目标蛋白种属不同,将非特异性位点结合掉,从而保证后续荧光染色的特异性。
5. 一抗孵育:用抗体稀释液将一抗稀释成目标比例,4℃过夜。
6. 一抗洗脱:第二天将湿盒拿出复温30 min,用1xPBS洗脱三次,每次5min;
7. 荧光二抗:用抗体稀释液稀释荧光二抗,室温孵育2 h,注意避光;
8. 二抗洗脱:用1xPBS洗脱三次,每次洗脱时间可稍长一些;
9. 封片:用含防淬灭的甘油进行封片,按需可以对细胞核用DAPI进行染色;
10. 拍片:晾干片子后,置于显微镜下观察,获取荧光图像。