标本制作：可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。
根据一抗是否直接带荧光标记，将免疫荧光染色分为直接染色或间接染色。
直接染色法是携带荧光素的抗体直接与标本内的抗原反应，形成抗原—荧光素标记抗体复合物，该法优点是较简单，特异性较高；缺点：应用范围较窄，敏感性也较低。
实际上在实验室中，我们最常使用的还是间接染色法，先用特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物。
下面以间接染色法为例展开叙述：
实验步骤：
1. 复温复温：取出制作好的样本（短期存放-20℃，长期存放-80℃保存），恢复至室温后，用1xPBS洗涤三次，每次 5 分钟；
2. 抗原修复：用0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）充分浸泡样本，微波炉中低火加热修复，保持微沸状态5 min效果最好；
3. 破膜：用 0.5%Triton X-100( 1xPBS配制 )室温通透20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. 封闭：封闭液蛋白的选择原则是与一抗蛋白和目标蛋白种属不同，将非特异性位点结合掉，从而保证后续荧光染色的特异性。
5. 一抗孵育：用抗体稀释液将一抗稀释成目标比例，4℃过夜。
6. 一抗洗脱：第二天将湿盒拿出复温30 min,用1xPBS洗脱三次，每次5min；
7. 荧光二抗：用抗体稀释液稀释荧光二抗，室温孵育2 h,注意避光;
8. 二抗洗脱：用1xPBS洗脱三次，每次洗脱时间可稍长一些；
9. 封片：用含防淬灭的甘油进行封片，按需可以对细胞核用DAPI进行染色；
10. 拍片：晾干片子后，置于显微镜下观察，获取荧光图像。
