聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
技术特点:
1、灵敏度高
PCR 产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg = 10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为 3 个细菌。
2、特异性强
PCR 反应的特异性决定因素:
引物与模板 DNA 特异正确的结合;
碱基配对原则;
Taq 聚合酶合成反应的忠实性;
靶基因的特异性与保守性。
3、简便、快速
只需要一次性将反应液加好后,就可以进行扩增。一般 2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
4、纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及 RNA 均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗漱液、毛发、细胞、活组织等 DNA 扩增检测。
标准 PCR 过程分为三步骤:
1、变性(Denaturation):
利用高温使 DNA 双链分离。DNA 双链之间的氢键在高温下(93 - 98℃)被打断。
2、退火(Annealing):
在 DNA 双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链 DNA 上。
3、延伸(Extension):
DNA 聚合酶由降温时结合上的引物处开始沿着 DNA 链合成互补链。延伸完成,则完成一轮循环,DNA 片段数增加一倍。往复循环这三个步骤 25-35 次,DNA 片段数将得到指数级增加。
结果检测:
PCR 反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。