正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定原理:
碱性条件下,蛋白质中半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、酪氨酸以及肽键,能将Cu2+还原成Cu+;2分子的BCA与Cu+结合,生成紫色络合物,在540-595nm有吸收峰,562nm处吸收峰最强。
测定操作:
1. 分光光度计预热30min,调节波长到562 nm,蒸馏水调零。
2. 工作液置于60℃水浴预热30 min。
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空白管 |
标准管 |
测定管 |
蒸馏水(μL) |
20 |
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标准品(μL) |
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20 |
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待测液(μL) |
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20 |
工作液(μL) |
1000 |
1000 |
1000 |
混匀后置于60℃保温30min,于1mL比色皿在562nm处测定吸光值A,分别记为A空白管、A标准管、A测定。 |
注意:空白管和标准管只需要做一次。
计算公式:
Cpr (mg/mL) = C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
= 0.5×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
Cpr (mg/g)= C标准品×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷ W
= 0.5×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷ W
W: 样本质量,g
注意事项:
BCA法蛋白含量测定试剂盒,适用于测定蛋白浓度在20-5000μg/ml样品。测定前取1-2个样做预实验,若A测定管-A空白管﹥1.5,需将样本用提取液稀释后再测定,以确保测定的准确性。