原代细胞指直接从胚胎、组织器官或外周血中提取的细胞，经特殊分离方法制备而成。常见类型包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞等。它们最接近体内生长状态，具有重要的科研价值。
根据组织类型和细胞特性，其分离方法有所不同，主要分为悬浮细胞分离法和实体组织细胞分离法。
1.离心分离
将悬液样本以1000–3000 r/min离心15–30分钟，使不同比重的细胞分层沉淀。
收集沉淀物，用无钙、镁离子的PBS洗涤2–3次，去除杂质。
用培养基重悬细胞，调整浓度后分瓶培养。
2.分层液纯化
若目标细胞位于悬液中层，可加入细胞分层液（如Percoll），离心后根据密度梯度分离不同细胞层。
1.机械分散法
l 操作：将组织剪碎至1–5 mm³，用剪刀或吸管反复吹打分散；或通过注射器针头压挤、不锈钢网挤压释放细胞。
l 适用场景：仅适用于纤维成分少的软组织（如脑组织、胚胎组织）。
l 缺点：机械损伤大，细胞分散效果差，纯度较低。
2.消化分离法
l 步骤：剪切组织至小块（1–5 mm³），用无钙、镁PBS漂洗2–3次去除抑制酶活性的离子。
加入消化酶（胰蛋白酶、胶原酶等）进行生化消化，使细胞间连接松动。
消化后轻柔弃去消化液，用机械法（吸管吹打、电磁搅拌）进一步分散细胞。
l 酶的选择与优化：
胰蛋白酶：适用于软组织（如肝、肾），工作浓度0.25%（含0.02% EDTA），消化时间30–60分钟。
胶原酶：适用于纤维多的组织（如皮肤、肿瘤），浓度200 U/mL，消化1–2小时。
EDTA：作为金属螯合剂增强胰蛋白酶效果，但需用血清终止消化。
三、细胞纯化与接种
1.纯化技术：
密度梯度离心：利用细胞比重差异分层（如淋巴细胞在Ficoll液中富集）。
贴壁筛选：混合细胞（如星形胶质细胞、神经元）接种后，更换培养基可去除部分神经元，1周后获得高纯度目标细胞。
传代纯化：小胶质细胞等难消化细胞，通过多次传代去除。
2.接种培养：
细胞悬液调整浓度（如5-10×10⁵个/瓶），接种于预处理的培养皿（如涂胶原层促进贴壁）。
培养基选择需匹配细胞类型（如DMEM用于肝细胞，高糖DMEM用于软骨细胞），并添加血清（10%胎牛血清）和抗生素。
四、关键注意事项
1.消化条件优化：酶浓度、温度、时间需根据组织类型预实验确定（如胶原酶浓度过高会导致细胞损伤）。
2.终止与漂洗：消化后立即用含血清培养基终止反应，避免酶毒性；漂洗动作轻柔防止细胞丢失。
3.细胞活性保护：全程保持低温（4℃或预冷PBS），减少离心时间（避免机械损伤）。
4.记录与溯源：详细记录组织来源、处理步骤及细胞代次（如P0代为原代），确保实验可重复。
通过上述步骤，可高效获取高活性原代细胞，为后续药物筛选、疾病模型构建等研究奠定基础。
