1、定义：荧光定量PCR（qPCR）中的CT值，全称Cycle Threshold，是指在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。这个值是荧光定量PCR最重要的结果呈现形式之一，用于基因表达量差异或基因拷贝数的定量分析。
2、原理：PCR扩增早期为指数增长期，此时模板量与荧光信号呈线性关系（公式：\text{模板量} \propto 2^{-\text{Ct}}模板量∝2−Ct），CT值直接反映初始模板浓度。
1、设定阈值：阈值通常设置为基线荧光信号标准偏差的10倍，这有助于区分背景信号和真正的扩增信号。
2、确定CT值：当荧光信号超过阈值时，所对应的循环数即为CT值。这意味着从这一循环开始，PCR产物的扩增进入了指数增长阶段。
3、确定基线：基线通常是扩增曲线的前3-15个循环，这些循环的荧光信号被用来设定背景信号的水平。
4、标准曲线的建立：通过制作标准曲线，可以将CT值转换为起始模板量或拷贝数。标准曲线是通过一系列已知浓度的标准品进行扩增，然后根据其CT值绘制的。
5、模板量与CT值的关系：起始模板量的对数与CT值呈线性关系，起始模板量越高，CT值越低；反之，起始模板量越低，CT值越高。
6、相对定量计算：使用2^-(∆∆Ct)方法进行相对定量时，首先计算每个样品的目的基因和内参基因的CT值，得到∆Ct（目的基因CT值 - 内参基因CT值），然后选择一个参考样品计算∆∆Ct（实验组∆Ct - 参考组∆Ct），最后通过2^-(∆∆Ct)计算相对表达量。
三、关键注意事项
1、阈值设定：须在荧光曲线指数扩增期起始位置手动或自动设定，避免平台期干扰。
2、内参基因选择：需验证内参基因（如T基因）在实验组和对照组中表达稳定，否则导致标准化误差。
3、重复实验要求：CT值易受RNA质量、扩增效率影响，需≥3次重复取均值以保障可靠性。
4、Ct值的重现性：
复孔Ct值差异应不超过0.05，以确保结果的可靠性。
Ct值的重现性依赖于指数扩增期的稳定性，此时微小误差未被放大。
5、Ct值的影响因素：
扩增效率（En）：理想的En在90%-110%之间，影响Ct值的准确性。
模板质量：降解或污染的模板可能导致Ct值异常。
引物与探针：引物设计不当、降解或不匹配会降低扩增效率。
反应条件：包括MgCl2浓度、退火温度和时间等，需优化以提高扩增效率。
抑制剂：模板中的抑制剂可能影响PCR反应，需通过稀释或更换模板解决。
6、实验设计与操作：
模板浓度：根据试剂盒说明书调整，避免过载。
预实验：通过预实验确定最佳稀释梯度和反应条件。
重复实验：确保数据的可靠性和可重复性。
7、数据处理：
使用标准曲线法或2^-ΔΔCt法进行数据处理，确保统计分析的准确性。
注意仪器、耗材和试剂的影响，选择合适的试剂盒和耗材。
CT值的重现性较好，但受模板浓度、扩增效率、试剂和仪器等因素影响，需要确保实验条件一致。扩增效率应控制在90%-110%之间，且CT值的理想范围为15-35，超出此范围可能需要重新评估实验条件或样品质量。
