Western Blot（WB）又名Western Bloting、Western、蛋白质印迹法、免疫印迹试验，Western Blot 基本原理：首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液处理以封闭膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
WB实验检测结果背景过高可能是由很多因素引起的：封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。
1、 封闭不完全
一抗或二抗只要结合到膜上，就会显色。为了避免非特异性的结合，应用封闭液孵育膜，使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐封闭液是3%的明胶，室温孵育1小时。如果想要低温封闭的话，可以用3%的BSA。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。
传统的牛奶/蛋白类封闭剂会形成较厚的、粘粘的蛋白层，导致与抗体发生非特异性相互作用，增加背景；另一方面，牛奶中本身含有的磷酸化蛋白会干扰蛋白磷酸化检测。
2、二抗不纯
没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用，产生杂带。这种情况可以选用单克隆的二抗。
3、显色过度
显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久，背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰可见，而背景几乎没有或很少时，将膜及时取出。
4、 洗涤不充分
在封闭以及抗体孵育之后，至少要洗两次膜，每次5分钟。去污剂的浓度不要太高，否则会把抗原从膜上洗下来。
5、 转移缓冲液或设备污染
使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净，海绵垫也一定要认真清洗，脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外，每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。
6、 抗体稀释度不正确
一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说，以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。抗体稀释度不够，会产生非特异的结合，带来高背景。
