GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映GCS活性。
测定步骤:
分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
工作液的配制:临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂五的配制:临用前在试剂五瓶中加入2.5mL试剂二充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
将工作液和试剂五置于37℃预热5分钟。
在1mL石英比色皿中加入50μL样本、50μL试剂五和900μL工作液,立即混匀,记录340nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:在该试剂盒中,若ΔA大于0.1,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使ΔA小于0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
GCS活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W
V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。