聚合酶链式反应 (PCR) 是分子生物学领域功能最强大的技术之一。实时荧光定量PCR 是在标准 PCR 技术基础上演变而成，常用于定量样本中的 DNA 或RNA。
利用荧光探针或荧光 DNA 结合染料，采用实时荧光定量PCR 仪检测荧光并完成 PCR 反应所需的热循环，实现扩增产物的定量。利用序列特异性引物，可测定特定的 DNA 或 RNA 序列的拷贝数。通过检测 PCR 循环的每个阶段中扩增产物的量，实现定量。如果样本中存在高丰度的特定序列 (DNA 或 RNA)，则在早期循环中即可观察到扩增；如果序列较少，则在晚期循环中方可观察到扩增。
一旦确定反应被抑制或效率较低，则可采取一些步骤将效率值重新调整到理想范围内。
1、对于抑制作用，可去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线。如果效率重新回到110% 以下，则分析良好。
2、另一种解决方案是重新纯化模板。切记应延长干燥时间，以去除乙醇沉淀过程中的乙醇，或采用另外的柱上洗涤液将离液盐从硅胶纯化物中去除。
3、通过分析优化可解决效率低下的问题。此过程有时相对简单，但在某些情况下，随着分析复杂度的提高，优化过程可能十分耗时费力。
4、扩增单个产物时，将镁的浓度提升至6mM 可提高反应效率，但当出现竞争作用时，则应降低镁的浓度。
5、在某些情况下(主要是多重反应中)，必须采用引物和探针优化基质。此时，需检测正向引物与反向引物的比值或浓度，有时甚至还需检测探针比值，以找出分析的理想浓度组合。最佳引物浓度介于100至600nM之间，而最佳探针浓度则在100nM至400nM 之间。
6、根据引物的Tm 值，确保热循环条件(尤其是退火温度)适当，且引物设计时使之有相似的Tm 值。
